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2bRAD-M 简化宏基因组

上架时间:2021-11-05
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产品介绍

应用案例

常见问题



产品介绍


2022 年 1 月 26 日,Genome Biology(IF:13.518)在线发表了由中国科学院青岛生物能源与过程研究所、中国海洋大学和欧易生物联合研发、共同署名的题为“Species- resolved sequencing of low-biomass or degraded microbiomes using 2bRAD-M”的技术文章。自此诞生了新的微生物组测序技术——2bRAD-M,该技术起源于 2bRAD 简化基因组测序技术(Nature Methods, Wang et al. 2012),通过 IIB 型限制性内切酶对微生物基因组酶切后获得的唯一标签(unique tag)进行微生物定性和相对定量分析,较传统微生物组测序技术有明显的技术特色和优势。


2bRAD-M技术文章下载链接:https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02576-9


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技术原理


2bRAD-M 技术原理如下图所示:采用 IIB 型限制性内切酶对基因组酶切,可产生 等长的酶切标签 tag(如,BcgI 酶可获得 32bp 等长标签),对 IIB 酶切标签进行扩增和 测序,然后通过“两步法”对微生物群落结构进行分析(包括细菌、真菌、古菌)。第一 步,我们通过预先建立的含有每种微生物 unique tag 的数据库(2b-Tag-DB)进行定性分 析,即筛选所有可检测到 unique tag 的微生物物种。第二步,对定性的微生物再次建立 2b-Tag-DB 并进行相对定量分析,即对上一步得到的微生物物种,根据 unique tag 分布 进行进一步的筛选和丰度估计。该策略能够高准确度、高灵敏度地检出微生物,可以同时检出细菌、真菌和古菌。


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技术特点及优势


种水平(species level)的物种检测分辨率

一次测序可同时检测细菌、真菌和古菌

高效处理疑难样本:低生物量(pg级别DNA)、严重降解样本(如FFPE)、高宿主污染样本等

高灵敏度:对丰度较低的微生物种类也有较高的检出能力

技术文章影响因子高:欧易生物共同署名发表在《Genome Biology》,IF:17.906

最新微生物组测序技术,具有创新性

欧易生物独家科研服务技术,已获批技术专利(ZL 201811467986.8)和技术商标;



技术对比


1. 2bRAD-M—VS—16S


优点:


① 种水平分辨率

② 一次实验同时检测细菌、真菌、古菌

③ 准确度灵敏度更高(2bRAD-M测的是覆盖整个基因组范围的tags,16S只测了16S基因的某段区域)


缺点:费用会略高于16S

 

2. 2bRAD-M—VS—宏基因组测序(WMS)


优点:


① 2bRAD-M对DNA质量要求较低,可以做宏基因组测序做不了的低生物量或严重降解的样本

② 2bRAD-M可以很好的应对高宿主污染的样本(组织/血液/拭子等)

③ 2bRAD-M较宏基因组测序费用低


缺点:目前不能检测病毒、不能分析基因的功能


1  2bRAD-M16S 和宏基因组(WMS)三种技术比较

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分析内容展示



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应用案例


高生物量样本(粪便)


2bRAD-M可以用于高生物量样本的分析,以下是最常见的、能反应肠道菌群的粪便样品的检测情况。在属水平,2bRAD-M与16S rRNA相比较,二者的微生物分类结果高度一致,相关性系数Pearson R=0.997,L2=92.0%;16S rRNA检出的大部分属(98.61%)在2bRAD-M中均检测到(见下图a,b,c)。在种水平,2bRAD-M与宏基因组相比较,二者的微生物分类结果一致性高,相关性系数Pearson R=0.974,L2=88.6%;宏基因组鉴定到的种水平物种,平均 99.92% 也被2bRAD-M检测到(见下图d,e,f)。


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2bRAD-M、16S rRNA、宏基因组在粪便样品的结果比较


低生物量样本(皮肤)


2bRAD-M可以用于低生物量样本的分析,如皮肤、拭子等。以皮肤样本为例,在属水平,2bRAD-M与16S rRNA相比较,二者的微生物分类结果高度一致,L2=81.1%。两种方法均发现葡萄球菌属和棒杆菌属是优势微生物,2bRAD-M在种水平上进一步发现,葡萄球菌属中丰度最高的是表皮葡萄球菌,而其他葡萄球菌没有显著差异,这是16S rRNA无法做到的。同时,2bRAD-M还检测到真菌,Malassezia restricta 和 Malassezia globose是丰度最高的菌,这两种菌是已知的人体皮肤表面共生菌。

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2bRAD-M可在低生物量样本中同时检测细菌和真菌


降解样本(FFPE)


2bRAD-M可以用于降解样本的检测,如石蜡样本(FFPE)、酒精或福尔马林保藏的样本、考古样本等,该类样本存在严重DNA降解、低生物量、高宿主污染、化学交联等问题。宫颈癌的癌旁(H)、良性宫颈癌(PreC)、恶性宫颈癌(InvaC),每种样本1张切片(4µm厚,3cm2),16S rRNA和宏基因组均建库失败。2bRAD-M分析显示,癌旁的alpha多样性显著低于PreC和InvaC(p<0.05)。PreC、InvaC和癌旁富集的菌株不同,PreC和InvaC显著富集Methyloversatilis discipulorum, Mycobacterium 290 tuberculosis, Methyloversatilis universalis, Ferrovibrio K5 291, Pseudomonas aeruginosa;癌旁显著富集乳酸菌,包括L. paracasei, L. 293 vaccinostercus, L. pentosus, L. plantarum。基于2bRAD-M检出结果,成功获得能够区分癌和癌旁的生物标志物。

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2bRAD-M 分析FFPE样本的微生物。a 为每组的Shannon指数;b为每组的差异微生物;c为三元相图,用于展示每组可能的生物标志物



常见问题


1. 微生物组测序,必须要测整个基因组才能达到种水平的分辨率吗?


答:并不是。2bRAD-M技术简化了整体基因组实现高效成本控制,并达到微生物种水平鉴定的分辨率。我们在计算上模拟了一个典型的宏基因组数据,并充分比较了全基因组和简化基因组在物种鉴定中是否存在差异。首先,我们从NCBI Refseq下载173,165个微生物基因组(171,927 细菌、293真菌、945古菌),用一种IIB酶进行电子酶切。例如,BcgI酶可在每个基因组产生3,010个等长标签,平均每个基因组种水平的unique tag为39.7%,这些unique tag就可用于种水平微生物鉴定和分类的标志物。总体来看,简化基因组标签数和GC含量与全基因组高度相关(r>0.98)。其次,通过50个物种的模拟宏基因组数据分析,我们发现2bRAD-M技术的精确率(98.0%)、召回率(98.0%)和L2相似性(96.9%)都非常高。因此,虽然2bRAD-M是一种简化宏基因组测序技术,只获得1%左右的基因组信息,但这1%的信息对整个基因组是具有代表性的,而且还提供准确的微生物群落结构。


2.高宿主污染样品,宏基因组一般会获得很多无用的数据,2bRAD-M也是如此吗?


答:2bRAD-M技术能克服高宿主污染,原因有三方面:

(1)2bRAD-M通过对具有代表性的1%的人类基因组和微生物基因组进行测序,大幅降低样品总体测序成本,并大幅增加了每个生物个体的测序深度。

(2)由于微生物基因组和人类基因组中酶切位点的高度不平衡,微生物基因组可以产生比人类基因组更多的2bRAD标签。例如,如果微生物DNA标准品(Mock-CAS)与人类DNA的比例为1:99,在实际测序结果中,二者的测序reads比例将变为3:97。

(3)人类基因组中的2bRAD标签与微生物基因组中的2bRAD标签完全不同。因此,2bRAD-M技术能有效抵抗宿主DNA干扰,大大降低假阳性率。而且,我们通过针对两种标准品(Mock-CAS: 含5种微生物的模拟菌群,ATCC MSA 1002: 含20种微生物的模拟菌群)的测试,也充分证实了2bRAD-M技术可处理高达99%宿主污染的样本(下图)。


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3.如果我的样本生物量/核酸量很低,有办法使用2bRAD-M检测其中的微生物吗?


答:可以的。通过针对两种标准品(Mock-CAS和ATCC MSA 1002)的分析, 我们已证明2bRAD-M技术能够有效处理低生物量微生物样本,可应对总DNA仅为1pg的样本,并且已成功应用到皮肤、室内地毯、汽车垫子等低生物量样本的检测中。以皮肤样本为例,在属水平,2bRAD-M与16S的微生物分类结果高度一致,均发现葡萄球菌属是优势微生物;但2bRAD-M可在种水平上进一步发现,葡萄球菌属中丰度最高的是表皮葡萄球菌,该属其他种没有显著差异,这是16S无法做到的。同时,2bRAD-M还检测到真菌,可在种水平揭示低生物量微生物群落新的细菌-真菌相互作用。


总结:2bRAD-M技术具有高性价比、高灵敏度、种水平分辨率、同时检测三大菌(细菌/真菌/古菌)的特点,并且能够有效地处理低生物量微生物样本、降解样本和高宿主污染样本。





样本准备指南


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